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海洋微生物抗肿瘤活性物质
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摘要：海洋多变复杂的环境导致了海洋微生物的多样性。海洋微生物因其具有产生新型生物活性产物的巨大潜力，已受到全世界海洋研究人员的重视。近年来，从海洋微生物中已分离到许多结构新颖的抗肿瘤活性物质。其中有的已进入临床试验，显示了良好的研究开发前景。
: d2 j$ L  b  d2 qAbstract: The changeable and complex environment of the ocean leads to diversity of marine microorganism. Marine microorganisms have been proved to be potential in producing novel bioactive substances. Marine-derived microorganisms are rich sources of bioactive compounds and thus they receive extensive attention from marine researchers. In recent years many new structurally-unique anti-tumor compounds have been isolated from marine-derived microorganisms, and some of them have been in clinical trials and showed better development prospects.
% f* m- @& ]+ K  k, c关键词：海洋微生物抗肿瘤活性物质筛选方法研究模型
Key words: marine-derived microorganisms; antitumor; bioactive substance; Method of screener; research model;
一、海洋微生物
, o& K1 L# O, D+ l) u/ a" g1.海洋微生物研究意义
! }$ g1 N$ K' ?海洋环境的特殊性(高压、高盐、低温、低光照、寡营养等)使海洋微生物具有丰富的生物多样性、独特的代谢方式和很强的再生、防御和识别能力。海洋微生物能产生一些结构新颖、活性特异的次级代谢产物以适应周围极端的生存环境。近几年，已有近万种新的海洋天然产物被发现，这些海洋天然产物具有抗癌、消炎、抗氧化、免疫调节等活性，已成为当今世界药物研发的热点，有的药物已进入临床实验阶段或已进入临床，并取得了丰硕的成果。
2.抗肿瘤活性物质
肿瘤是现代社会威胁人类健康的重要疾病。多年来，各国学者致力于寻取新型、高效、低毒的抗肿瘤化合物。对海洋微生物次级代谢产物中具有抗肿瘤活性的有关研究表明，醚类、大环内酷类、菇类、含氮杂环类、肤类、酞胺类及醌类化合物均具有良好的抗肿瘤活性。
' l$ E' o. \/ M# f二、海洋抗肿瘤活性物质的分类（450）
1.海洋放线菌的抗肿瘤活性物质（150）
3 }( ~8 Q( ?3 l# i$ ~海洋放线菌的生活环境十分特殊，如高盐、高压、低营养、低温等。在这些生命的极限环境，海洋放线菌已发展出独特的代谢方式，同时提供了产生独特的生物活性物质的潜力。例如，中国海洋大学药物与食品研究所、军事医学科学院毒物药物研究所的科研人员对海洋放线菌S1001发酵产物进行了分离和研究，并用理化手段综合分析了其中的抗肿瘤活性成分，取得了较为满意的结果。近年来，研究者从海洋放线菌中分离出的主要抗肿瘤活性物质，见表1。
                              

                               
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4 l9 m9 x: [2 e( I3 {' q2.海洋真菌的抗肿瘤活性物质（150）
- }( [; X# C6 ~, E8 l% c% E2 _海洋真菌是海洋微生物的一个主要分支。目前，从海洋真菌中分离出近300种具有抗菌、抗肿瘤及抗病毒等生物活性的新化合物，其具有结构新颖、作用独特等特点。研究者从海洋真菌中分离出的主要抗肿瘤活性物质，见表2。

1 _8 ?" K' R9 x                               
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3.海洋细菌的抗肿瘤活性物质（150）
海洋细菌大都是从海洋沉积物、海水、海藻、海洋动物体表等分离获得，其代谢产物多具有抗肿瘤活性，是海洋微生物抗肿瘤活性物质的一个重要来源。例如，日本冈见分离到一株黄杆菌属的海洋细菌代谢产生杂多糖Marlnactan，能够增强免疫功能和抑制动物移植肿瘤，并成为化疗药物治疗肿瘤的佐剂。Custafso等从海洋细菌中分离到大环内酯类化合物Macro—lacfins24元内酯环、吡喃型葡萄糖和一个开链的酸构成，其中rmcrolactinA组分是一种配糖体母体，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等功能。主要抗肿瘤活性物质，见表3。
                              

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8 o8 ^% i+ z8 O. b# o9 h三、海洋抗肿瘤活性物质作用机理（200）
* A9 B# w- K# ~% |1. 海洋生物活性物质的抗肿瘤作用机制
海洋生物活性物质的抗肿瘤作用机制呈多样性，包括:干扰肿瘤细胞有丝分裂和微管聚合，直接杀伤肿瘤细胞;抑制蛋白质合成;调节蛋白激酶C的合成;抑制肿瘤新生血管形成增强机体自身防御体系;诱导白细胞介素一2、肿瘤坏死因子、干扰素分泌。科学家多在以上机制的基础上研发各种抗肿瘤药物。
$ G2 ^: q8 x- ^$ T; F0 p# p/ X& e2.海洋微生物多糖抗肿瘤的作用机制
（1）调控细胞周期及相关蛋白质合成，进而抑制肿瘤细胞增殖，诱导癌细胞分化，促使癌细胞死亡
* C8 q* O6 }. q* o0 ?! P（2）通过增强机体抗氧化、清除自由基作用抑制肿瘤细胞增殖。
! c; m) z* N* G! }4 V肿瘤细胞恶性增殖将导致细胞内活性氧的不断增多或者细胞清除活性氧的能力直线下降，通常表现为患者体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性急剧下降，而刺激细胞发生癌变的重要诱因是活性氧所引起的细胞氧化性损伤，因此海洋微生物多糖可清除自由基并且增强机体抗氧化作用，达到抗肿瘤的目的。
（3）其抗突变、抗遗传损伤的作用可有效抑制肿瘤细胞增殖。
* V8 I( n" F" u, V; R% k目前多数细胞恶性肿瘤是由辐射引起的，在辐射强烈或持久的环境下细胞内的DNA易发生变异，细胞的调控机制不能正常识别和发挥。而海洋微生物多糖大都具有抗辐射、抗突变的作用，进而产生一定的抗肿瘤作用。
9 _0 J" k) R9 l3 P3 N7 b3 y（4）海洋微生物多糖还具有促进肿瘤细胞凋亡的作用，对肿瘤细胞有直接杀伤力。
四、海洋抗肿瘤活性物质的筛选、分离和提取（1100）
1.海洋抗肿瘤活性物质的筛选
海洋微生物次级代谢产物种类繁多，如果要从中寻找到对癌症治疗有效的化合物，就需要建立对癌症病症模拟真实的高效药物筛选模型。抗肿瘤药物初筛主要应用的是体外筛选模型。
4 l4 G; N0 p. k- y* D) H（1）高通量筛选模型
) }% V, X0 [- h. l- G7 j大规模、自动化筛选或称高通量筛选(high-Lhrough pul screening,HTS)模型是一套有效的快速培养筛选方法，是选取包括生命中发挥重要作用的受体、酶、离子通道和核酸等生物分子，以及与细胞增殖和分化有关的信号传递系统和癌基因表达系统作为靶点，是用机器人在培养板上进行样品的取样、分装、测试等操作，是一种规模化、自动化、精确、有
                               效的现代化筛选方法。该方法每天可以处理几百到几千个样品.样品越多越能体现其优点。
2 W$ t0 d0 l: M+ e- x+ c例如美国Cyanamid公司的研究人员运用独特分子筛选技术，对从世界各地采集的海洋微生物进行测试，以找到有抗菌、抗病毒或抗癌征兆或作为治疗心血管、神经系统疾病苗头的药物。
（2）微生物模型
, d# B; B  r+ A4 `此方法多用于海洋微生物中抗肿瘤物质的筛选。BIA筛选法是利用遗传学方法构建的一株具有γ—lacZ片段的溶源性E. coli为指示菌株，该菌株在正常条件下不产生β—半乳糖苷酶，但当培养介质中含有能作用于DNA的化合物时，菌株就会被诱导产生β—半乳糖苷酶。因此，通过检测是否有β—半乳糖苷酶产生就可初步确定样品中是否含有能够作用于肿瘤细胞DNA的物质。不少天然抗肿瘤活性药物能使肿瘤细胞DNA受损伤起作用，因此，利用BIA法来检测天然产物中是否具有这种作用机制的抗肿瘤活性物质较为简便、快速而且特异性也较高。
（3）体外细胞毒试验模型
# O- S1 T$ v& I8 H8 R体外细胞毒试验是通过检测离体培养细胞加样后的存活率，来确定样品活性程度的一种活性筛选方法。主要有四唑盐比色法、磺酞罗丹明B比色法和染料排斥法等。
四唑盐比色法原理是基于四唑盐(商品名噻唑蓝，简称MTT)可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶的蓝紫色结晶物(formazan , FMZ )，而死细胞没有这种能力。沉积在活细胞中的FMZ用二甲亚矾(DMSO)溶解后，溶液呈现的颜色深浅与FMZ含量成正比，再用酶标仪测定OD492，可间接反映活细胞数量。通过进一步分析就可以知道细胞存活率(或死亡率)为50%时的半抑制浓度，从而作为细胞毒检测的指标。
一般情况下所说的细胞毒试验也就是指MTT比色法。该方法灵敏度高、重复性好、操作简便，口前已广泛应用于大规模的抗肿瘤药物筛选。
（4）抗稻瘟霉孢子法
稻瘟霉是一种植物病原菌，属于多细胞丝状真菌。以孢子出芽方式繁殖，在环境适合条件下，由孢子长出芽管，逐渐延长成菌丝。稻瘟霉属真核微生物，它具有细胞壁及细胞核等真核细胞的特征。
  G) R, K. y7 y+ L; A6 W. @  T2 m大量的抗肿瘤化合物有明显的致稻瘟霉菌丝体弯曲作用或抑制稻瘟霉分生孢子生长的作用，说明化合物使稻瘟霉生长抑制和产生形态上的变化与抗肿瘤活性之间存在一定的相关性，为利用稻瘟霉这一模型筛选抗肿瘤活性菌株提供了一定的试验依据。这种模型虽不能替代肿瘤细胞毒试验，但较为迅速，不需贵重设备，在化合物初筛，提取物的活胜追踪分离或不具备条件而要筛选大量样品时非常适用。
（5）针对作用机制设计的模型
随着基因工程学科的发展，人们对细胞增殖、分化和恶性转化的分子机理，尤其是对癌基因和抗癌基因的蛋白产物参与肿瘤细胞中的信号传导途径及诱导肿瘤细胞凋亡的认识不断深入，许多大型制药公司建立了以作用机制为基础的筛选模型(mechanism-based assay)。
这些模型是以人类疾病发生生化过程中的相关酶或受体为分子靶标来设计的，被认为是与人类疾病相关性较好的模型。将针对机理的筛选方法与针对疾病的体外人类肿瘤细胞株系的筛选方法相结合起来，不仅可以寻找抗癌的细胞毒药物，而且可以寻找到癌细胞分化及细胞凋亡诱导剂、生物反应调节剂和癌化学预防药物等，大大地拓展了抗癌药物的研究开发领域。
* q3 Q8 V( i& a（6）其他筛选模型
还有一些快速简便的筛选生物活性的鉴定系统，包括海胆卵、海虾毒性生物鉴定。其中，海胆卵鉴定方法是在海胆卵受精后5 min内加入样品，对照组出现第1个卵孵化的时间为2h后，如果样品浓度为16 g/mL或更低能抑制80％—100%的受精卵孵化，则表示有一定活胜。该方法鉴定结果可能为细胞毒性，需进一步用其他筛选模型验证。
9 W; b4 ^' B9 _2.海洋抗肿瘤活性物质的分离和提取
# h" T& _7 Q* w1 x3 ~2 g海洋微生物产生的天然代谢产物具有结构复杂、多样性、高生物活性等突出特点。因此海洋生物活性物质的筛选、提取、纯化是一项十分困难的工作，用传统的化学方法难以实现，近年来，新的分离技术已经发展起来
+ f, o$ g+ V$ A' d4 y                               （1）萃取技术
8 l1 w/ n- _1 J5 z0 U( H1 m传统的萃取技术已经不适用于抗肿瘤活性物质的分离，近年来，一些新的萃取技术显示了良好的应用前景。比如超临界流体萃取技术和反胶束萃取技术。
超临界流体萃取技术：超临界流体萃取技术是以超临界状态下的流体为溶剂，利用该状态下的流体所具有的高渗透能力和高溶解能力分离混合物的过程。最常用的超临界流体二氧化碳，己经被广泛使用。
2 ?& o, A, d  s  M2 L9 h（2）膜分离技术
% B/ G* K2 i9 |8 u4 m8 R  D膜分离是用天然或人工合成的高分子薄膜以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质进行分离、分级、提纯和浓缩的过程。膜分离过程是一项有效、节能、无污染、保持原料性能不变的物质分离技术。近年来，微滤、超滤、反渗透、纳滤和亲和—膜过滤等各种膜分离技术发展迅速，在天然活性物质的提取和海洋药物的研制中更显现出其技术优势。
（3）色谱方法
海洋微生物活性成分多而结构复杂，有效成分的分离、纯化很困难，而色谱分离技术则是这类物质精细分离的有效手段。主要包括也液相色谱、高速逆流色谱和超临界流体色谱。
液相色谱：液相色谱法作为一种分离手段，是根据混合物种不同组分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，这些组分在两项间进行反复多次的分配，从而得到分离。主要包括、吸附色谱、分配色谱、离子色谱、体积排阻色谱、亲和色谱等。
9 [! ^" _7 v2 Z超临界流体色谱：超临界流体色谱以超临界流体为流动相，超临界流体色谱具有气相色谱和高效液相色谱的优点，在室温下即可分离热不稳定性、沸点较高或分子量较大的物质，同时还具有柱效高、分离速度快的特点，可用通用的灵敏检测器。
五、海洋抗肿瘤活性物质产业化
1.存在的问题
; g0 C# Z& z+ E对于筛选到的含有活性物质的微生物，还存在有效成分含量低、难分泌到胞外、培养生物量低、培养难度大等问题，这都限制了海洋微生物天然活性物质生产的工业化和临床应用。采用现代生物技术是最好的解决途径。利用基因工程、细胞工程、蛋白质工程和发酵工程等，从多方面解决海洋抗肿瘤药物研制中遇到的难题。
) U* {# j: e0 ~- b6 t3 r0 ?2.解决方法
例如，利用基因工程对原微生物菌株的改良或将天然活性物质的基因克隆到其他易于培养、生长繁殖迅速或代谢物易分泌到胞外的微生物，以提高天然活性物质的含量和产量，大大降低生产成本。
! P+ w* w3 c. J/ X8 e利用海洋微生物的培养与发酵技术的研究。利用微生物发酵技术的成熟工艺、后处理工艺、分离纯化技术及高度自动化生物反应器等实现海洋微生物天然活性物质生产的工业化并不断降低生产成本，加速从研究开发到产品化的过程。
六、结语
海洋微生物的抗肿瘤活性产物研究是一个被广为关注和方兴未艾的研究领域，新化合物或其他新发现的数量越来越多，论文报道渠道也越来越扩展，新信息量与日俱增，新知识日趋丰富。近年来，海洋微生物中抗肿瘤活性物质和海洋药物方面的研究取得了较大进展，发现了许多具有显著生物活性的新型化合物，其中一些还具有较好的药用前景。随着生物技术的发展和海洋微生物资源开发利用的进一步深入，预计未来定会实现海洋微生物活性次级代谢产物的规模化生产，使海洋微生物成为开发新药的重要来源。我们应该充分利用我国海洋微生物的资源优势，研究开发具有我国自主知识产权的海洋微生物天然产物，不仅具有必要性，而且具有美好的产业化前景。
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