酶法制备海洋活性肽及其功能活性研究进展 - 海洋地球化学循环研究进展

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原标题:酶法制备海洋活性肽及其功能活性研究进展

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摘 要:海洋生物活性肽(Marine biological active peptide)是从海洋生物中提取的具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽。酶法制备海洋生物活性肽是目前最常用的制备方法,是通过适当的蛋白酶水解海洋生物蛋白来制备生物活性肽的一种方法。海洋生物活性肽在降血压、抗氧化、抗凝血及抗菌等方面效果显著,对治疗和预防疾病具有巨大潜力。介绍海洋生物活性肽在酶解制备及其生物学功能方面国内外研究进展,为进一步开展海洋活性多肽研究提供参考。

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海洋生物资源丰富、种类繁多、生物链健全及再生能力强,海洋生物约占全球生物总量的一半。多变的生活环境、漫长的进化历程使这些生物具有与陆生生物不同的生理性状,并产生许多结构新颖、作用特殊的生物活性物质,是新型生物活性物质的巨大来源,具有很大的开发潜力。生物活性肽(biological active peptide)是指具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽。一般由蛋白质酶解制得,通常含有 3-20 个氨基酸残基,它在原蛋白质序列上没有生物活性,但是通过酸、碱或酶水解释放后具有生物活性,其活性取决于它们的氨基酸组成及其排列顺序[1]。海洋生物是开发生物活性肽的良好资源,近年来人们已从海洋生物、海洋加工的副产物中提取出许多不同种类的生物活性肽,它们不但可以为人体提供营养成分,而且还具有许多生物学功能,如降血压、抗凝血、抗菌、抗氧化及提高免疫力等。随着消费者在饮食与健康方面意识的提高,对功能性食品成分和保健营养品的认知和需求也逐渐增加,来源于海洋生物和海洋加工副产物的生物活性肽,因为其具有安全、无毒副作用、价格竞争力强等优点在功能性食品的开发中极具潜力。本文介绍了海洋生物活性肽在酶解制备及其生物学功能方面国内外研究进展,为进一步开展海洋活性多肽研究应用提供参考。

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1 海洋生物活性肽酶法制备工艺

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目前海洋生物活性肽的提取方法主要有 3 种 :溶剂萃取、微生物发酵和酶水解。由于酶水解法没有有机溶剂及有毒的化学品的残留已成为食品和制药工业的首选方法。酶法制备生物活性肽是通过适当的蛋白酶水解蛋白来制备生物活性肽的一种方法。在酶法制备的过程中若要获得理想的提取率,蛋白酶的选择、酶解条件的选择、分离技术这三方面至关重要。

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1.1 水解酶的选择

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目前在工业生产上用酶法制备生物活性肽应用比较广泛的蛋白酶主要有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等内肽酶。由于不同的蛋白酶酶切位点不同,同一蛋白片段在使用不同蛋白酶酶解后,所得的产物生物性质将差异很大。如胰蛋白酶只催化水解碱性氨基酸所形成的肽键,底物特异性较窄,所以酶切位点相对较少,酶切片段较大 ;木瓜蛋白酶能作用于蛋白质中 L-赖氨酸、甘氨酸、L-精氨酸和 L-瓜氨酸等参与形成的肽键,底物特异性较宽,所以其酶切位点较为广泛,所得酶切片段分子量相对较小。因此,在开发特定功能的生物活性肽时要根据要求选择合适的一种或几种蛋白酶。2007 年 Zhao 等[2]对酶解海参蛋白发现使用菠萝蛋白酶、脘酶及碱性蛋白酶 3 种蛋白酶共同作用,水解效果要优于单一蛋白酶。2008 年,陈忻等[3]利用波纹巴非蛤制备生物活性肽发现使用木瓜蛋白酶酶解效果比菠萝蛋白酶好,而且其酶解温度低、用酶量少和水解度高。2001 年,Byun 等[4]对明太鱼鱼肉蛋白进行酶解制备 ACE 抑制肽时发现中性蛋白酶、胶原酶、碱性蛋白酶具有良好的水解效果,所得酶解物降血压能力较强,而且 3 种蛋白酶具有协同水解效应,但胃蛋白酶水解效果比较差。因此合适的蛋白酶选择较为重要。

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1.2 酶解条件的研究

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酶解时间、蛋白酶最适 pH、蛋白酶最适温度和加酶量,以及料液比是影响最终多肽得率的重要因素。首先,酶解时间对多肽得率至关重要,在酶解过程中多肽得率呈现了 4 个阶段 : 迅速上升阶段,缓慢增长阶段,稳定阶段,轻微下降阶段,其中稳定阶段多肽含量最高。国内外许多酶法制备海洋生物活性肽的研究已证实这种蛋白酶解曲线[5, 6]。因此,在酶解过程中,必须掌握好酶解时间。其次,蛋白酶的最适作用温度、pH对多肽得率影响显著。在不同的反应体系中,要根据底物浓度、种类及缓冲液等因素来设定蛋白酶的最适作用温度、pH 等反应条件。2007 年,Qian 等[7]研究不同蛋白酶水解金枪鱼肌肉时优化出各种酶最适反应体系,表明不同蛋白酶的最适反应体系不同,具体见表 1。最后,加酶量、料液比也是影响最终效果的重要因素,在一定程度上影响酶与底物的反应速率。2008 年,陈忻等[3]用优化木瓜蛋白酶酶解波纹巴非蛤制备生物活性肽,反应条件表明,木瓜蛋白酶在 50℃、酶解时间 4 h、pH6.3 条件下,加酶量 4%、料水比 1 3 时水解度最高为 40.83%,结果要明显优于其他条件。由以上可见,最佳酶解条件是影响海洋生物活性肽提取率重要因素之一。

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1.3 酶解产物的分离纯化研究

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酶法水解后蛋白质分解成长度不一的肽链,但生物活性肽的分子量大小在很大程度上决定其生物特性,所以要获得特定功能特性的生物活性肽,分子量是较重要的因素之一[8]。酶法水解后如何提纯是酶法提取的重中之重,目前常用的分离纯化方法有超滤法、有离子交换层析法、凝胶过滤柱层析、体积排阻色谱、毛细管电泳、膜分离、HPLC、离子交换色谱、吸附分离、反渗透,以及一些方法的联用技术。超滤法分离手段是通过采用适当规格的超滤膜来分离纯化出想获得的分子量大小的肽类,超滤法不但可以纯化多肽而且对多肽起到一定的浓缩作用,这种方法操作简单,因此成为目前众多研究者首选方法。2008 年,Zeng 等[9]通过超滤法从牡蛎水解液制备抗菌肽时分离得到 4 种不同分子量的多肽 :<1 kD、1-5 kD、5-10 kD 和 10 kD。其中分子量在 5-10 kD的多肽具有较强的抗菌活性。但超滤法一般得到特定分子量的多肽片段,要想获得单一成分,还需要通过交换层析技术与其它色谱技术相结合,然后通过电泳、氨基酸分析仪、质谱等来检测其纯度。2007 年,Je 等[10]从金枪鱼鱼骨的酶解液中,通过连续的色谱分离得到一个抗氧化肽,利用电喷雾质谱测定其序列为 :Val-Lys-Ala-Gly-PheAla-Trp-Ala-Asn-Gln-Gln-Leu-Ser。2004年,Uchida等[11]从一株海洋细菌发酵液中,利用 DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱、Sephadex G-100 分子筛凝胶柱分离得到一个蛋白酶多肽,通过氨基酸分析仪分析,纯化出的多肽由 14 个氨基酸组成其序列为 :Ala-Gln-Ser-Val -Pro-Tyr-Gly-Gln-Ile-Lys-Ala-Pro-Ala-Leu。

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目前实验室方法制备生物活性肽还不适合工业化生产,在选择合适的蛋白酶条件下,应通过控制酶解过程各个环节来实现。已报道[12]两种制备海洋生物活性肽的较有效方法 :一是可以使用一个三酶系统使酶进行连续水解 ;二是将多步循环膜反应器和超滤膜系统联合使用,使酶连续水解。多步循环膜反应器技术装备和超滤膜系统的联用是近年来一种新兴的分离生物活性物质的方法,具有广阔的应用前景。

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2 酶法制备的主要海洋生物活性肽的功能特性

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2.1 抗高血压肽

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高血压是全世界最常见的心血管疾病之一。目前商品化的抗血压类药物大都是人工合成的药物,如甲巯丙脯酸、依那普利等,但均有一定的副作用。因此,寻找安全天然抗血压药物来替代合成药物成为目前抗高血压研究的迫切需求,其中降血压肽作为天然抗血压药物潜力巨大。降血压肽是一类血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)可以抑制 ACE 活性从而使血压下降。

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近年来,以海洋蛋白为原料制备降血压肽的研究越来越多,1986 年,Suesuna 等[13]最先从带鱼和沙丁鱼水解物中发现了 ACEI。在之后的数年里从明太鱼、金枪鱼、海参、文蛤和对虾等海洋动物分离得到部分海洋抗高血压肽(表 2)。海洋抗高血压肽抑制 ACE 的活性很高,目前普遍采用 IC50 来表示这些海洋生物活性肽的效价,即海洋抗高血压肽浓度达到 50% 时对 ACE 活性的抑制效率,然后采用双倒数作图法来表述抗高血压肽对 ACE 的抑制模式。竞争性 ACE 的抑制多肽是当前研究的热点之一,这些多肽能结合到 ACE 的活性部位或通过结合到远离活性部位的位置来改变酶的构象,从而使酶的作用物不能结合到其活性部位达到抑制其活性的目的。2007 年 Zhao 等[2]报道了一些海洋抗高血压肽也有竞争性途径,通过小鼠试验证实了其对 ACE 具有较有效的抑制活性,从金枪鱼骨架蛋白水解产物中提取的抗高血压肽其氨基酸序列(表 2),通过口服试验(10 mg/kg),结果表明患有自发性高血压大鼠的心收缩血压明显降低,其效果类似于西药甲巯丙脯酸。对大目鲔中提取的抗高血压肽进行大鼠试验,证明此抗高血压肽无任何毒副作用,在体内的活性要高于体外。关于海洋生物活性肽抗高血压肽的降压机理目前还没有一致的观点,部分学者认为是海洋抗高血压肽与西药甲巯丙脯酸相比具有更强的组织亲和力,所以被清除的速度慢,药效要更为持久。海洋抗高血压肽在预防和治疗高血压的保健品和药物中的比例逐渐增大,当然抗高血压活性肽的市场开发利用还需要进一步进行基础研究和临床试验。

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2.2 抗氧化肽

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自由基是机体氧化反应中产生具有强氧化性对人体有害化合物。目前存在许多人工合成的抗氧化剂, 如 BHA、TBHQ、BHT 及 PG 等。但是人工合成抗氧化剂对人体健康存在潜在危害,所以其用量必须严格控制。因此在食品工业中寻找安全无毒的天然抗氧化剂替代人工合成抗氧化剂显得尤为重要。

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近年来大量的研究表明,从各种海洋生物蛋白水解液中分离得到的多肽,具有潜在的抗氧化能力。目前国内外报道已从乌贼、牡蛎、蓝贻贝、长尾鳕、竹荚鱼及鳕鱼等海洋动物中分离得到抗氧化活性肽。这些海洋生物抗氧化活性肽能有效地清除机体内的自由基和活性氧或者通过阻断脂质过氧化过程中的自由基链式反应来预防因氧化而造成的机体损伤。2005 年 Mendis 等[14]从洪德堡鱿鱼分离得到的生物活性肽组分在亚油酸自氧化体系中的抗氧化活性要明显高于 α-生育酚,已经接近 BHT 的水平。1995 年,Shahidi 等[15]报道了绞碎的猪肉肌中添加 0.5%-3.0%的毛鳞鱼蛋白水解液,可使猪肌肉的次级氧化产物包括 TBARS 减少 17.7%-60.4%。评估海洋抗氧化肽的活性,一般采用自由基清除能力、金属离子螯合能力及淬灭单线态氧能力等多种评价方法进行体外活性试验评估,经筛选出的具有抗氧化活性的物质可通过体内试验进一步检验评估[16]。目前海洋多肽作为抗氧化剂的准确作用机制尚未明确,但是一些研究发现,组氨酸含量较高的海洋多肽,具有金属离子螯合作用 ;海洋多肽结构中芳香族氨基酸的酚羟基基团能够作为有效的电子供体 ;疏水性氨基酸在很大程度上决定抗氧化活性肽的效力,如明胶肽富含疏水性氨基酸,所以其疏水性增强了明胶肽的抗氧化性和乳化效果。Mendis 等[14]报道了洪德堡鱿鱼皮明胶抗氧化肽 P1 和 P2 的抗氧化性是由于富含间隔的“亲水 - 疏水”序列。部分海洋抗氧化肽的序列结构,见表 3。因此,海洋抗氧化肽将会在保健品和药品行业,以及作为人工合成抗氧化剂替代品方面具有很大开发潜力,特别是在功能食品中添加无毒副作用的海洋抗氧化肽,将会成为食品行业一个新的研究方向。

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2.3 抗凝血肽

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血流通畅是维持生命的必要条件,在生物体内同时存在着凝血机制和溶血机制,这两种机制必须维持在一定的平衡状态,才能保持血液流通顺畅[17]。肝素作为抗凝血药物已经有 50 多年的历史,目前广泛应用于预防静脉血栓栓塞性疾病。但是以肝素为代表的大多数传统抗凝血药物均会有一些不良反应,因此限制了广泛、长期应用。

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目前关于海洋生物抗凝血肽的报道相对较少,但有报道从海洋蠕虫、海星、蓝贻贝、血赤贝和黄鳍等海洋生物中分离得到了具有抗凝血活性的肽。上述海洋抗凝血肽的抗凝血活性是通过检测活化部分凝血酶原时间(APTT),凝血酶原时间(PT)和凝血时间(TP)的延长得到的,并且将其活性与商品抗凝血剂肝素进行了比较。2008 年,Jo 等[18]报道了从海洋蠕虫中分离得到的抗凝血肽,其氨基酸序列为:Gly-Glu-Leu-Thr-Pro-Glu-Ser-Gly-Pro-Asp-LeuPhe-Val-His-Phe-Leu-Asp-Gly-Asn-Pro-Ser-Tyr-Ser-Leu-Tyr-Ala-Asp-Ala-Val -Pro-Arg, 可 以 有 效 延 长 凝血时间(TP),活化部分凝血酶原时间(APTT)由32.3 ± 0.9 s 增加到 192.2 ± 2.1 s,并且其效果与剂量呈正相关。另外,2009 年 Jung 等[19] 报道从蓝贻贝中分离得到的抗凝血肽,其氨基酸序列为 :GluAla-Asp-Ile-Asp-Gly-Asp-Gly-Gln-Val -Asn-Tyr-Glu-GluPhe-Val -Ala-Met -Met -Thr-Ser-Lys,分别可以使凝血酶原时间(APTT)从 35.3 ± 0.5 s 增加到 321 ± 2.1 s,血浆凝血酶时间(TT)从 11.6 ± 0.4 s 增加到 81.3 ± 0.8 s。2001 年 Jung 等[20]报道从角毛蚶中提取的多肽可以使部分凝血酶原时间(APTT)从 32 s 增加到 325 s,其效能相当于 2.8 μg /mL 的商品抗凝血剂肝素。由于从海洋生物中分离得到的抗凝血肽无细胞毒性,作为保健食品或药品的功能性成分都具有巨大潜力。

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2.4 抗菌肽

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抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽,分子量通常低于 10 kD[21]。自从 1981 年 Steiner 等[22]首次从昆虫中分离得到抗菌肽以来,迄今为止,在不同的哺乳动物、昆虫和植物中已分离得到 700 多种具有抗菌作用的蛋白质和多肽。

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海洋生物种类众多,其中海洋无脊椎动物,由于其单独依靠体内免疫机制抵抗入侵细菌或病原体,因此内源性抗菌肽丰富,也成为开发天然抗菌肽的重要资源。目前已报道从蜘蛛蟹、牡蛎、美洲龙虾、绿海胆及青蟹等海洋无脊椎动物的血淋巴中分离出抗菌肽。表 4 列举了部分海洋抗菌肽氨基酸序列或主要功能氨基酸。2008 年,Liu 等[23]报道了从牡蛎中提取出抗菌肽 Cgpep33,对大肠杆菌、铜铝假单胞菌、枯草杆菌等多种细菌以及葡萄孢菌、青霉菌等真菌都有较好的抑制作用,而且抗菌肽 Cgpep33对以上细菌和真菌的 IC50 值仅为 18.6-48.2 μg/mL。同年,Stensvag 等[24]从蜘蛛蟹中提取出的抗菌肽Arasin-1,能抑制谷氨酸棒状杆菌。该抗菌肽具有较好的 pH 和温度稳定性,在 60-80℃处理 20 min 其抗菌活性基本没有变化。海洋抗菌肽不但对细菌、真菌具有较强的抑制作用,而且还有抗病毒的能力。1998 年 Lee 等[25]报道了利用嗜热菌蛋白酶水解牡蛎 贝 肉 得 到 的 Leu-Leu-Glu-Tyr-Ser-Ile 和 Leu-Leu-Glu-Tyr-Ser-Leu 两种多肽能很好地抑制 HIV-1 的复制。此外,2008 年 Zeng 等[9]也报道了通过酶解法酶解牡蛎得到的一种多肽,其氨基酸序列 :Arg-ArgTrp-Trp-Cys-Arg-X,当 X 是一种氨基酸或氨基酸类似物时,此种多肽能抑制孢疹病毒的增殖。

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近年来关于微生物对传统抗生素类物质产生抗药性的报道越来越多,所以目前急需开发新的抗菌类物质。海洋抗菌肽因其具有原料来源广泛、抑菌谱广及无毒副作用等优点,具有巨大的开发潜力。但是目前开发海洋抗菌肽因存在分离纯化较难、提取步骤繁琐及成本较高等问题而限制了其开发应用,所以如何提高抗菌肽的生产效率、降低成本,得到安全、稳定的海洋抗菌肽将会对未来抗菌肽的发展和应用起关键性的作用。

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2.5 其他肽类

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海洋抗癌多肽具有活性高、稳定性好等特点,是肿瘤医学上一个研究热点。目前研究表明从海洋动物提取的化合物 10% 具有抗癌活性[26]。1987年,Pettit 等[27] 从海兔体内分离得到抗肿瘤肽Dolastatin-10,对人乳腺癌、肺癌有显著疗效。2006年,吴杰连等[28]从文蛤中提取出 MGP0501 抗癌肽能有效抑制体外培养的人肺癌细胞株、卵巢癌细胞株、宫颈癌细胞株、鼻咽癌细胞株和肝癌细胞株等的生长。高 F 值寡肽是一种具有高支链氨基酸含量和低芳香族氨基酸含量组成的小肽混合物,具有治疗或缓解减轻肝性脑病症状,抗疲劳治疗苯丙酮尿症,改善手术后及卧床病人的蛋白质营养状况,以及解酒精等功能。目前采用海洋蛋白制备高 F 值寡肽的研究较少,所以进一步开发海洋蛋白资源具有重要的现实意义[29]。另外,海洋源生物活性肽,如钙螯合肽、免疫活性肽的研究也取得了一定的进展。2006 年,Jung 等[30]从明太鱼和海吉鱼中提取出抗骨质疏松,肽即钙螯合肽,适用于东方人的乳糖不耐症,也可作为含钙较高的乳制品的替代品,同时还可以预防骨质疏松。

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3 展望

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3.1 海洋低值水产品及水产品加工副产物开发活性肽的前景

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海洋特殊的环境,使得海洋生物含有许多陆生动物所没有的天然活性物质。我国是渔业大国,2010 年我国水产品总产量达 5 373 万 t,已经连续20 多年居世界第一位。随着我国水产中加工产业的发展,加工过程产生大量的加工副产物,如鱼头、鱼骨和内脏等。以罗非鱼为例,罗非鱼是是世界水产业的重点科研培养的养殖鱼类,鱼片利用率仅占整条鱼的 46%,而鱼片加工副产物却占 54%,其中鱼头占 26.5%,内脏占 6.8%,鱼排占 16.5%,鱼鳞占 2.2%[31]。但目前对这些加工副产物的开发利用较少,大部分只作为低值饲料使用,而这些加工副产物中含有丰富的活性物质。如鱼磷中含有丰富的胶原肽,内脏中含有丰富的内源蛋白酶,水产蛋白中含有各种功能的活性肽,所以利用生物酶技术,开发海洋低值水产品及水产品加工副产物中的功能活性肽,不仅使海洋资源得到有效利用,而且为人类提供更多功能性食品和药品,具有广阔的应用前景。先通过酶解技术提取出各种生物活性肽然后再生产饲料,降低了开发海洋生物活性肽的成本,提高水产品及其加工副产物的利用价值和经济价值。

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3.2 酶法制备活性肽技术的完善

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在酶法制备海洋生物活性肽技术方面目前仍需要完善,一方面将酶工程的先进技术应用于开发海洋生物活性肽,积极探索开发蛋白酶制剂新资源,大力加强新型蛋白酶制剂的开发 ;另一方面积极开发酶解条件的优化方面的软件,以及尝试将正交试验或响应面法和遗传神经网络法相结合对酶解制备海洋生物活性肽工艺进行优化,通过结合遗传神经网络模拟酶解过程,可使酶解反应条件优化精确度更高。建立高效灵敏度高的活性肽分离、鉴定、分析平台。应尽快开发适用于产业化生产的活性肽分离设备,使得海洋生物活性肽能够尽快从实验室进入产业化生产。

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3.3 海洋活性肽的应用研究

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海洋生物活性肽在人类营养与健康方面起着重要的作用,在功能性新食品或药品中添加海洋生物活性肽,可以通过调节日常饮食来预防或调节慢性疾病。目前各种酶解海洋生物蛋白制备的抗氧化活性肽和抗高血压肽的研究取得了比较大的进展,并已经有部分产品应用于商业,但其他活性肽,如抗凝血肽、抗菌肽和免疫活性肽等未得到很好的开发。

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目前对海洋生物活性肽研究多数尚处于实验室阶段,必须进行深入研究。一方面虽然海洋生物活性肽作为功能性食品、营养食品,以及药品的活性添加成分具有广阔空间,但目前为止,已分离得到的海洋生物活性肽大多数只仅仅通过体外实验和老鼠试验,证明其安全无毒,但在体内活性和应用效果方面的研究较少。要想进一步开发海洋生物源蛋白酶解产生的肽类物质的应用价值,必须对其现有活性进行深入探讨与研究。另一方面可以考虑对海洋生物活性肽化学结构进行修饰,直接提取的肽类物质可以通过聚乙二醇化、糖基化等方法对肽类化学结构进行修饰,这样可以使海洋生物活性更强、性能更稳定,更利于开发利用。

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虽然海洋生物活性肽在普遍应用方面还有些技术问题尚待解决,但我国作为一个海洋渔业大国,海洋生物资源极为丰富,加之依托我国高校及科研院所等科研平台,相信海洋生物活性肽在新型海洋保健食品、功能性食品以及医药行业中有着巨大的应用潜力。

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文星雨
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