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' t3 a& W2 I, s+ v' ]$ c; r 广阔的夜空有几颗星，浩淼的海域有几条鱼，是科学界一直努力解答的问题。各种各样的环境包括土壤、沉积物、排泄物、空气、水体中生活着不同的生物个体，这些生物个体的各种痕迹会携带着自身DNA掉落到四周环境中，这些释放到环境中的DNA，便是我们所说的环境DNA（Environmental DNA, eDNA）。 1 }0 J1 c3 t3 w
图1 环境DNA技术利用Metabarcoding技术对环境样本中的环境DNA进行检测，可以获取环境样本中DNA所属物种的分类学信息和基因功能信息，进而研究不同生态环境中物种的多样性，追溯物种来源、发展以及变化。
) b B+ S1 U q! h( `4 X+ t 图2 环境DNA（eDNA）示意图01、eDNA技术在鱼类多样性检测中的应用 - U9 e- d! k. J8 w9 X6 E' \: b9 ]
在过去的十年中，使用从环境中分离的DNA进行研究的数量迅速增加，特别是对于淡水和海洋等水生生态系统。海洋生物多样性研究为海洋资源的可持续发展提供了坚实的理论依据。既往研究中，拖网捕捞是使用最广泛的海洋动物多样性研究方法。但拖网捕捞的方法受到渔具自身特性，例如网目大小、开口面积和展开参数，例如拖网速度、深度和深度变化等因素的制约。除了环境破坏性和耗费时间较长外，在海洋环境中拖网捕鱼在很大程度上具有选择性，会影响物种组成的多样性评估与认知。 6 N$ z7 @: [8 Z" l1 [
图3 传统方法调查海洋生物多样性这些生态系统承受着巨大的人为压力，其生物多样性以及相关的生态系统过程受到了非常严重的负面影响，因此，需要有效的管理来改善这种情况，而这取决于对生物群落状态和变化的准确、及时和可靠的评估。近年来，随着技术的不断完善，环境DNA宏条形码技术在鱼类多样性调查研究中的优势愈发明显。相比于传统的捕捞、拖网监测技术，环境DNA宏条形码技术更为敏感，对生态环境影响小，能够检出更多的鱼类物种，并且具有高时效性，非专业人员也能在较短的时间内进行大规模采样。因此，环境DNA宏条形码技术在鱼类多样性物种监测中的意义不可估量。 ; O) B( ^) X1 `; }: i
图4 eDNA监测鱼类多样性eDNA宏条形码技术通过采集水体样本eDNA，选取特定序列扩增并进行高通量测序，而后进行序列检索比对来鉴定环境中存在的目标生物类群物种组成。动物线粒体遗传稳定，序列保守，因此常被用于物种分类研究。例如，鱼类线粒体12S rRNA、细胞色素C氧化酶亚基I（CO1）等，该序列片段研究广泛、容易扩增，而且在物种之间也有很高的差异，现广泛应用于鱼类多样性研究。 0 d" {8 c0 ^1 c& h3 I
" C+ n- F4 @4 \9 { 02、凌恩生物自建鱼类条形码数据库 & m$ G4 I, U8 b* ~# A4 Q
凌恩生物基于MitoFish和GenBank等公共数据库，自建了覆盖全面、准确、丰富的MitoFish数据库和GenBank鱼类线粒体数据库。目前包含鱼类物种4,932种，其中海水鱼类1,639种，淡水鱼类3,293种。同时提供个性化数据库构建，能够满足各类个性化服务要求。针对鱼类物种的环境DNA宏条形码技术，凌恩生物通用引物推荐如下，其他eDNA扩增引物设计具体请和凌恩生物联系。 # _' ^9 r+ m$ A" T
● 淡水鱼类12S推荐引物
( A) [0 z" o5 s* T Tele02_F 5′-AAACTCGTGCCAGCCACC-3′
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4 I/ F# f7 f, @& w/ G ● 海水鱼类12S推荐引物 3 g* m+ C. g( ^* L3 }! w
MiFish-E-F：5’-GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC-3’
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● 鱼类生物COI推荐引物
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/ d! ?8 ?- L/ {8 w 03、相关文章研究示例 4 l! o+ j, u8 Q! W- n
( M0 H/ Z& |+ c s 标题：环境DNA方法揭示北京地区不同水体生境的原生和外来鱼类多样性分布特征 9 v9 q( l" E2 M6 }2 C) \
期刊：Science Advances（IF=14.136）
8 i' }* f( ^6 F( x7 g! }9 ^+ E& @* U 时间：2022.2.11 ' b! n! Z- A( M2 J/ V2 ~5 @
本研究选择北京为研究区域，对从市中心到远郊区的109个静水（湖泊型）和动水（河流型）水体开展了基于eDNA的鱼类多样性调查。通过采集水样提取eDNA，并结合鱼类12S rRNA metabarcoding和高通量测序，共鉴定获得分属于9个目的75种鱼类MOTU，包括52个本地原生鱼种和23个外来鱼种。同时对水体进行水质理化指标的测定，并结合每个采样点周围的地表覆盖数据，分析这些环境指标如何在精细空间尺度上影响静水和动水的原生和外来鱼类多样性分布。 , }; N& {7 o3 z* A, e+ P
图5 北京地区地表覆盖类型及本研究109个采样点分布研究结果表明，北京地区具有较高的鱼类多样性，但非本地鱼种占据了全部鱼类多样性的30%之多；鱼类群落同质化较为明显，但不同水体类型间鱼类群落组成也存在一定差异。在静、动水体中的本地鱼种多样性均对水质指标化学需氧量(COD)呈现显著负相关，且在静水中COD影响尤甚；外来鱼种对COD响应远低于本地鱼种，显示本地鱼类多样性对水质更加敏感，而外来鱼种具有更高的环境耐受性。 - o5 J1 p* s8 @, r2 F
图6 本地/外来鱼种在静水/动水中的检测出现次数图7 本地/外来鱼种在静水/动水中检测到的多样性比较此外，静水中本地物种多样性随距城市中心距离的增加而下降，相反的动水中本地和外来鱼类多样性均随距离增加呈现非线性增长，并且动水中的外来鱼类占比在郊区高于城市中心，提示非本地鱼种可能通过河流从周边地区引入，并在郊区建立种群。 % O7 I; ]) X& o. h4 }$ ^7 p1 Z
图8 广义加性模型(GAM)显示本地和外来鱼类物种丰富度对COD及距城市中心距离的响应关系这些结果对科学管理城市水生生态系统和保护本地物种具有重要的指导意义，同时充分显示了eDNA方法应用于城市水生生物多样性监测的巨大潜力。
- `7 `# Y! g5 Q% r7 O1 f3 J: Q 04、凌恩生物eDNA送样要求
; x2 z/ j8 G) Y* b 从环境中获取高质量的DNA片段是成功检测的前提。eDNA的获取包括环境样本的采集、保存和提取等步骤。eDNA样本制备及送样要求如下： 样本类型样本要求备注滤膜1-2张（生物学重复建议3-6个）1. 取1-2 L左右水，使用0.22um滤膜过滤（有大颗粒杂质是可先过滤0.45um滤膜）。滤膜置于冻存管中，至少重复4管。2. 样本寄送。滤膜液氮速冻，置于-80℃冰箱保藏，干冰寄送到实验室。干冰用量建议以3kg/day计算，一般建议10kg起。1. 由于环境DNA存在一定的衰减，收集到水体后请尽快过滤膜。2. 同一水域多次采集，一般每个样品做3-10个平行样，尽量覆盖采集区域以增加检测到目标物种的概率。3. 样品珍贵，请老师做好样本备份。05、凌恩生物鱼类eDNA分析流程 9 K% L$ x# P! F) ?6 u0 ~3 p( [2 Q
凌恩生物倾心打造全新eDNA鱼类生态调研分析流程，鱼类物种多样性调研基础上，联合捕捞数据一致性分析，同时自行构建海水和淡水鱼类数据库，让注释结果更加真实可靠。
; m8 F6 [7 g" R% c" u; w% W# u 图9 凌恩生物鱼类eDNA多样性分析流程（1）鱼类物种多样性分析(部分分析示意图) O2 O: F7 l) F# d* e3 ]
鱼类群落组分图优势鱼类丰度气泡图鱼类群落距离依赖曲线（2）捕捞数据一致性分析（部分分析示意图）
/ i. T. B# A H. O/ l1 `( k 鱼类物种检出率比较物种检出一致性热图物种数量和检出率共线性分析参考文献 9 [! X9 k' p/ x2 B! j8 `- v
[1] Zhang S, Zheng Y, Zhan A, et al. Environmental DNA captures native and non-native fish community variations across the lentic and lotic systems of a megacity. Science Advances. 2022.
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[3] Zhang S, Lu Q, Wang Y, et al. Assessment of fish communities using environmental DNA: Effect of spatial sampling design in lentic systems of different sizes[J]. Molecular Ecology Resources, 2020.
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