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2004年Science杂志上报道海洋水体和沉积物中的塑料碎片问题，首次提出微塑料(microplastics，MPs)的概念。
j8 a! K+ X, p1 P% W) f4 y! r/ ~* X MPs通常指粒径<5mm的塑料颗粒、碎片或者纤维。 " L. z3 D. K6 U9 ?+ Y' y9 n
作为水环境中普遍存在的一类新污染物，MPs因粒径小、难降解等特点，其生态环境危害和健康风险备受关注。
2 h6 @. y m2 Y5 p) C5 C; w 2022年5月我国国务院办公厅印发《新污染物治理行动方案》中明确指出微塑料是当前危害生态系统和人体健康的四大新污染物之一。
; a+ V+ V& e4 d 已有多项研究证实，水体环境中MPs可被多种水生生物(鱼类、浮游动物、浮游植物、贝类等)摄取进入体内，进而诱发一系列的直接毒性效应，包括生长抑制、炎症反应、能量耗竭、代谢紊乱及肝脏毒性等。
+ e) A" Z# A9 t) B9 K4 G 鉴于实际环境中MPs的多样性、持久性及可迁移性，MPs(特别是环境相关浓度)的环境生物效应仍需进一步探究。
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多数研究表明，MPs在低浓度、短时间内暴露对水生生物无显著毒性效应，相比于高浓度MPs的直接毒性研究，其对共存污染物的影响更受关注。
7 S1 K! G' Y O Y MPs可通过疏水作用、静电作用、π-π键或氢键作用吸附共存的重金属和有机污染物，进而影响其生物有效性和生物学响应。 % H, g# _0 X0 j. y- f8 G: l
例如，MPs可吸附并浓缩水体中疏水性有机污染物，增强十溴联苯醚和酚类抗氧化剂在海洋扇贝和斑马鱼体内的富集和毒性作用。
' ^* [/ i+ q' A; N+ C) c8 P) ?/ A/ } 另有研究表明，MPs可显著降低多环芳烃、多氯联苯和双酚A在斑马鱼、金鱼和大型蚤体内的富集含量和致毒效应，主要是因为吸附有机污染物的MPs聚集沉降后降低暴露体系中有机物的赋存浓度，且MPs的快速排出可促进有机物在生物体内的净化。 , V0 E3 b' Y8 N# W- p. c( p
相对于MPs直接毒性效应研究的一致性结果，其对共存污染物生物效应的影响更为复杂，结论也更为多样，这可能是MPs-共存污染物-生物三元复合体系中不同相互作用过程的结果，亟待进一步补充研究。 - p; E' j( m( V0 c7 Q8 j( D4 Y
4 X+ N3 V3 f6 Z3 |- G! m; E; q7 u- _9 a 有机磷系阻燃剂( organophosphateflameretardants，OPFRs)因其优越的阻燃、增塑、润滑等性能被广泛应用到电子、纺织、化工、建材及塑料等产品中。! n+ t J m N
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OPFRs主要以物理掺杂而非化学键结合的方式添加到产品中，在相关产品的生产、使用和处理等过程中极易从材料中释放出来进入环境。
9 U* A/ `0 T& i8 J$ s 磷酸三(1，3-二氯异丙基)酯(tris(1，3-dichloro-2-propyl)phosphate，TDCIPP)是一种高产的氯代OPFRs，在地表水、沉积物、空气、室内灰尘等环境介质和贝类、鱼类等生物体内均普遍存在。 * P4 O0 T: |) F' X3 ]
实验证明，TDCIPP具有较强的生物危害作用，包括发育毒性、生殖毒性、肝脏毒性、神经毒性、内分泌干扰效应和潜在致癌性。 % f; q) O" ~8 }9 U0 J) u
9 k; O) S2 n# s, z% m" o: P1 H 在水体环境中，TDCIPP的毒性效应易受共存污染物的影响。 , j7 i* h. g! t
我们之前的研究发现，氧化石墨烯共暴露可通过激活线粒体呼吸链提高能量代谢缓解低浓度TDCIPP对斑马鱼幼鱼的发育毒性效应。 + u8 z5 l" I. v& U
Ren等研究发现，纳米二氧化钛可作为载体吸附TDCIPP，促进TDCIPP在斑马鱼肝脏、脑部和性腺组织内的生物富集，并增强其生殖毒性。
( k" G$ }' i) f 大量研究表明，肝脏是TDCIPP毒性效应的靶器官，TDCIPP对鸡胚胎、大鼠和斑马鱼等均表现出明显的肝脏毒性。
5 n5 l# O* r' Y% w TDCIPP作为一种疏水性有机污染物(log Kow=3.65，25℃)，疏水性MPs的共存是否会显著影响其对典型水生生物的肝脏毒性效应还不可知。 # g2 j7 Z: A/ R
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聚酰胺(polyamide，PA)是广泛应用于服装、皮带、渔具、汽车轮胎等家庭和工业产品中的工程塑料。 4 J5 X3 t) Y2 Q% Q$ F8 o) }
调查显示，PA是目前地表水、鱼体、人体肠道和粪便中检出频率和丰度最高的MPs之一。 ' B- B* ~ H4 z; e' D4 V
研究发现，PAMPs可影响共存有机污染物的生物富集及毒性效应。 & N) M5 h4 W; W7 b
例如，Rehse等研究发现，PAMPs共存可显著降低双酚A在大型蚤(Daphniamagna)体内的富集，并降低双酚A对大型蚤的急性毒性；Yang等研究发现PAMPs可减弱壬基酚对小球藻(Chlorellapyrenoidosa)生长发育和叶绿素合成的抑制效应，主要是因为MPs吸附有机物后的团聚和沉积降低水相中有机物浓度；Bartonitz等发现PAMPs吸附菲后可降低菲的生物可利用性并缓解菲对淡水甲壳类动物钩虾(Gammarusroeseli)的致死亡作用。 * _# D- [4 F4 N
. s; ]/ z( c. G* y& x$ X' ^3 |* { 近期我们的研究发现，PAMPs对水体中TDCIPP的有效吸附及肠道流体内的快速解吸，使PAMPs作为载体促进了TDCIPP在成年斑马鱼肠道和生殖器官内的富集，增强其对斑马鱼肠道的损伤效应和传代发育毒性。 ! A$ D- v' g# ?4 k7 {) A, T
然而，与聚苯乙烯(PS)、聚乙烯和聚氯乙烯相比，有关PAMPs对水体共存污染物生物效应的影响研究相对较少，尤其是环境相关浓度下的研究还极少见报道。
" v4 I1 t5 @- z ?. a 高通量代谢组学技术可通过动态监测生物体内所有代谢物含量的变化来灵敏指示外来干扰物在组织和器官水平的毒性效应，尤其在解析生物对低浓度污染物的响应机制中具有不可替代的作用。
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基于此，本实验以PAMPs和TDCIPP为研究目标，以成年斑马鱼(Daniorerio)为模式生物，开展环境浓度PA与TDCIPP的单一及复合暴露实验，通过分析斑马鱼体长、体质量、肝体指数、肝脏TDCIPP富集含量、氧化损伤和组织病理学损伤等指标的变化，探讨环境浓度MPs对TDCIPP斑马鱼肝脏毒性的影响，并借助代谢组学技术揭示其相关分子机理，研究结果可为复合污染环境中MPs的生态效应及健康风险评估提供重要的理论基础和科学依据。 9 L8 M' I3 h8 n) T, F7 R
7 i+ s( r1 z8 H* } 不含添加剂的PAMPs粉末(粒径5~20μm，密度为1.13g∙cm-3)购自上海冠步机电科技有限公司，TDCIPP标准品(CASNo.13674-87-8，纯度>98.0%)、对三联苯-d14(CASNo.1718-51-0，内标物质)、色谱纯二甲基亚砜(DMSO)、二氯甲烷、乙腈、正己烷和丙酮购于上海安谱实验科技股份有限公司。 甲基-N-(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(MSTFA；CASNo.123746，纯度>98.0%)和O-甲基羟胺盐酸盐(CasNo.189571，纯度>98.0%)购于北京百灵威科技有限公司；4%多聚甲醛固定液、分析纯乙醇和二甲苯购于阿拉丁试剂有限公司。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒和磷酸盐缓冲液(PBS；pH7.4)购于武汉赛维尔生物科技有限公司。 2 U N R! z5 }8 m4 L0 W I1 H
活性氧(ROS)、总超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、细胞白介素(IL-6)和三磷酸腺苷(ATP)含量分析生化试剂盒均从南京建成生物工程研究所购买。 ( o* O+ Y! S" {4 E2 u
& G. ]+ | |6 S. z0 F0 [( x7 h6 t 利用扫描电子显微镜(SEM；JSM-6390LV，日本株式会社日立高新技术公司)观察MPs形貌，使用激光粒度仪(S3500，麦奇克，美国)分析MPs粒径分布，利用傅里叶变换红外光谱仪(FTIR；Spectrum400F，PerkinElmer，美国)分析MPs表面官能团，接触角测定仪(ThetaFlex，百欧林，瑞典)确定MPs的疏水性。 + c" m$ a2 z9 O Z" Y
体长和体质量大致相同的野生型斑马鱼(3个月龄，AB品系)购自上海费曦生物科技有限公司，将成鱼置于装有控温装置和过滤系统的鱼缸中驯化培养14d后进行暴露实验，实验分为空白对照组、PA单独暴露组(100μg·L-1)、TDCIPP单独暴露组(0.4、2和10μg·L-1)、PA+TDCIPP联合暴露组(100μg·L-1 PA+0.4、2或10μg·L-1 TDCIPP)。
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由于环境介质中MPs的检测技术所限，已有研究地表水中MPs的含量几乎均用颗粒数表示，如particles·L-1和particles·m-3。
4 k1 k# Y( O f+ N, G 据报道，中国、意大利、法国和日本等国家地表水中MPs的丰度为0.82～10516particles·m-3，质量浓度约在ng·L-1到mg·L-1之间。
5 E$ c3 \" m4 {) g5 P 高污染区域海水中MPs的浓度可达7800particles·L-1(质量浓度约为4500μg·L-1)，平均浓度在3～23μg·L-1之间。 S6 a" p: U4 O s
Goldstein等指出北太平洋亚热带环流中MPs浓度可达300μg·L-1。
% F4 H, Z. X/ D2 n6 E& Y* u! s 本实验使用PAMPs的浓度为100μg·L-1，具有一定的环境相关性，也是目前许多毒理学实验中使用的最低浓度之一。 ; M3 r9 j( W9 @& S! |6 p8 V
依据中国连云港水体(0.377μg·L-1)和日本固体废物处理场附近水体(6.18μg·L-1)[36]中TDCIPP检测浓度分别设置TDCIPP染毒低剂量和高剂量。 . k% Y0 {6 u0 A7 d4 i8 t
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因此本实验中MPs和TDCIPP染毒浓度均为环境相关浓度。 . m4 R6 P$ p, d) @8 v# c+ p, @8 x+ m
染毒溶液使用含60mg·L-1海盐的去离子水配制，空白和处理组中均加入0.01%DMSO为助溶剂，每个浓度设置3个平行鱼缸。 * k: b# B3 X& L( o2 V
实验过程中水体连续充气，并用玻璃棒不定时搅拌，以保持MPs悬浮状态，水体温度为(26±1)℃，14h光照/10h黑暗，每天早晚各喂一次新鲜孵化的丰年虾，喂食30min后清理剩余食物残渣，并定时清理鱼体排泄物，保持水体干净，2d更换1/2染毒液。
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经暴露4个月后，去离子水清洗鱼体，三卡因麻醉，滤纸吸干鱼体表面水分，测量其体长、体质量；冰浴解剖取出肝脏，称量质量，计算鱼的肝体指数(HIS)=肝质量(g)×100%/体质量(g)。
1 ?+ j7 [: q5 v0 | V9 n 部分肝脏组织用4%多聚甲醛固定，4℃保存，用于组织病理学分析；剩余肝脏组织，-20℃保存，用于TDCIPP含量测定和生化指标分析。 U, j p- E" u a2 M
实验动物的培养、染毒、解剖和生物样品的收集严格按照国际经济合作组织中斑马鱼毒性测试的要求进行，严格遵循河南师范大学科研实验伦理规范和《动物实验管理条例》相关规定。
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