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! k3 {# h) f0 ?9 ^% H; @8 @ 文 | 璐璐有话说 - A/ p$ ^* B. H$ q$ ^/ _$ E
编辑 | 璐璐有话说 & n/ T/ k& Z9 Z
«——[ ·引言· ]——»
8 X( F- o: ?: u 微生物群落是由各种微生物种类组成的复杂生态系统，它们与甲藻之间存在着相互作用和相互影响，本次研究中，探究了微生物群落与甲藻生长、生理状态以及环境因素之间的关系，揭示它们之间的相互作用机制。 ; a7 \, _- m Q# I% j1 d$ \
实验结果表明，在甲藻繁殖的不同阶段，微生物群落的丰度和多样性呈现出明显的变化，特定微生物群落的丰度在甲藻繁殖的不同阶段可能会显著增加或减少，这些结果对于进一步理解海洋生态系统中甲藻繁殖过程的生态学机制具有重要意义。
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2 d' G3 v" Z6 a$ X8 j «——[ ·DNA提取和PCR扩增· ]——»
; `/ U" j1 _( F5 B 将保存在戊二醛中的海水样品用二脒基，苯基吲哚染色15分钟，然后过滤到0.22μm孔径聚碳酸酯过滤器上，使用落射荧光显微镜（×1000放大倍率）计数细菌细胞，每个样品中至少计数10个视野和 >50 个细胞。
8 @4 s" r$ O( H 使用快速DNA旋转试剂盒提取DNA，并在50 μL TE缓冲液中洗脱，并在-20°C下储存直至进一步使用。
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+ f; ~8 m( X; V, o$ q. e0 u. x2 L+ ` 原核生物16S rRNA基因（V4-V5高变区）使用引物F515和R907进行扩增，这些引物在计算机中被证明可以靶向几乎所有的古菌和细菌，并为微生物序列的分类学分类提供了足够的分辨率。
) ]1 [% p$ U- q' B8 _ 将8 bp条形码添加到正向引物中，并将样品一式三份扩增，使用引物547F和952R进行真核生物扩增，它们靶向4S RNA基因的V18区域，扩增在一式三份的50 μL PCR中进行，每个引物含有0.5 μM、反应缓冲液。
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2.5 mM MgCl2、200 mM dNTP、0.8 μg/mL BSA、2.5 U GoTaq Flexi DNA 聚合酶和 10 ng ，PCR循环条件是2°C下94分钟，10 次循环 94°C 持续 30 秒，65°C 持续 30 秒（每个周期降低 1°C 持续 30 秒，2°C 持续 30 秒），18 个循环，94°C 持续 30 秒，55°C 持续 30 秒，72°C 持续 30 秒;最后延伸72°C10分钟。 & Y9 K- F1 i1 j( t5 M7 `7 P
对PCR产物进行合并、清洁和浓缩，通过合并每个样品中大约等摩尔量的PCR产物来制备用于焦磷酸测序的单个复合样品。
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鉴定和去除嵌合序列，根据先前的方法修剪和过滤原始序列读数，在去除低质量的读数后，使用比对工具（BLAST）对核糖体数据库项目进行注释，并用来自主要海洋分类群的16S和18S rRNA序列进行补充。
5 x0 w6 q, B- N8 Z# a/ \ 去除平均相对丰度小于0.1%的OTUs微生物序列，并使用剩余数据创建Spearman秩相关矩阵，如果斯皮尔曼秩相关系数（rho）为>0.6，P<为0.05，则确定共现模式是稳健的。
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8 d& T( e; b$ g3 N0 y$ K) h 应用这两个过滤步骤去除代表性差的OTU并降低网络复杂性，这有助于确定样品中的核心微生物群落，隶属关系网络被定义为一个网络，其中成员基于团体的共同成员资格或共同参与某种类型的活动而相互隶属。 7 M# k( k1 |- `
使用函数从双模隶属关系网络中提取不同属之间的直接连接，重建网络中的节点表示可变分类群，连接节点的边缘表示属之间的相关性。
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从样本中选择了具有代表性的专业属的子集，帮助识别潜在的关键分类群及其在网络中的相互作用，目标网络上的信息进一步组织在矩阵中，每个样本的α和β多样性指数使用Mothur计算。
% X1 l7 I& P! M: [) o9 B 主成分分析（PCA）用于显示和比较不同样品之间的微生物群落组成，并采用典型对应分析（CCA）将微生物群落的变化与环境性质联系起来，通过变异分割分析（VPA）检查环境因子对CCA分析确定的微生物群落结构的影响，显著差异定义为P<0.05或P<0.01。
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" Z2 H1 J' G! I+ v% ]0 N# h «——[ ·处理 16S/18S 序列· ]——»
4 J6 E& f, O2 T; h/ b0 z' D 在采样期间，温度、盐度和pH值分别为5.2至16.8°C、29.8至33.1和8.06至8.36，每个时间点的营养浓度显示在数字，NH的最高和最低浓度4+和否3-分别在水华开始和水华高峰期检测到（P < 0.01）。
: k- E7 j- m' V9 R2 J 连环状腺菌细胞密度范围为1.5×102至 3.1 × 104采样周期内的细胞/L，细菌的总丰度范围为1.7×105至 1.2 × 106细胞/mL，最大值出现在水华峰值细菌总丰度与连环蒿水华相关，两组种群动态均出现滞后现象。 1 S9 `5 H" Q# G t3 X4 G
( h" J4 a$ W/ m& b. G 使用97%的相似性临界值，从现场样品中总共获得了4859个细菌OTU，517个古菌OTU和3452个真核生物OTU，为了研究生物多样性的变化，计算了浮游细菌群落。
! X1 v6 H* A0 v; a6 b 在整个连环蒿水华期间，为细菌组计算的Chao1指数保持相对稳定，仅在水华终止的起点增加，香农指数在整个花期相对稳定。 + k; p0 X2 q' x! a- Q
与细菌/古菌群落相比，真核群落的Chao1指数显著较低，并且在整个开花期间相对稳定，在为不同抽样期计算的香农和辛普森指数中观察到波动，最明显的变化出现在水华下降之初（W6，05-14-2014），其中观察到最低的香农和最高的辛普森多样性指数。
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, n; w* ]& h, k' Q% m 微生物群落β多样性的模式（OTU组成的样本差异）显示在数字，其中颜色强度反映了物种组成的相似性，在细菌中，采样期之间的一般差异趋势为I组（W1-W3）>II组（W4和W8）>III组（W5-W7和W9）。
2 |) ?3 L; y3 }/ K& h' H% @: H W3在水华发育期间收集的W<>在样品间群落组成差异最大，古菌样本分为三组，尽管有一些重叠，但在很大程度上对应于采样的时间段，不同采样期差异最大，在下降阶段，β多样性指数相对较高（W7和W9），而其余样本表现出相似的群落组成（II组）。
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拟杆菌和变形杆菌是所有水华阶段的两个主要优势，开花高峰期拟杆菌的平均比例（65.3%）高于开花前（30.6-51.5%）和开花后阶段（21.5-53.1%），与拟杆菌相比，变形杆菌表现出相反的模式。 1 s9 {- I, W& J+ r; @
α变形杆菌在高峰期和下降阶段占主导地位，β变形杆菌和Delta变形杆菌出现在开花后阶段，两组的丰度比例分别为5.1%和2.8%。
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# ^ z1 U6 R, o- F# z( ? 随着水华的进展，观察到细菌群落发生了显着变化，蓝藻簇在水华下降（W30）开始时显著增加（6%），此后逐渐减少，放线菌组随着时间的推移逐渐增加，并且在水华下降期间观察到最大比例丰度（约4.2-10.7%），不同水华期，螺旋体科、候选分类WS3和酸杆菌的比例较低，占<1%。
; I# v5 u9 B4 B* }, H 与细菌相比，检测到的古菌相对较少，古菌的比例约占整个原核生物群落的6-10%，在最丰富的OTU（属级）中，>50%属于产甲烷菌种（产甲烷菌科、甲烷菌科）。 $ m% i7 D5 i# e* I0 y
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11-21%属于氨氧化古菌（AOA），5-30%属于盐杆菌科;3-10%属于热等离子体，2-9%属于其他物种，甲烷微生物在第一个采样期占主导地位，其比例丰度从开花期到指数生长期显著增加（至60%）。 : B T1 a# ^8 k: X c! t
盐杆菌和热等离子体在水华下降期间存在，这些分类群的丰度在开花后期增加，占整个古菌群落的35-40%，样品中的主要细菌分支，是黄杆菌、交替单胞菌、杜鹃杆菌、海洋螺旋菌、硫菌、鞘杆菌、弯曲杆菌、脱硫杆菌、梭菌和胞吞噬，占总质量读数的>98%。 3 _ Q1 D0 K& v. z/ d3 Q) V$ T3 y
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一些类群在藻华发育过程中表现出明显的变化，黄杆菌在水华发作期间逐渐增加，在高峰期达到最大比例丰度，然后随水华下降，丰度随后随着水华的终止而增加。 4 \+ _. ]/ w, Y* l! D
与黄杆菌相似，红杆菌在水华初期显著增加，在水华开始下降时达到最高比例丰度（W7），随后下降，交替单胞菌是比例第三多的目，随着开花的进展，总体呈下降趋势，随着水花的发展，鞘翅目和海洋螺旋藻分别呈逐渐增加和减少的规律。 . o/ ~( ]6 }6 _0 _6 l: X8 q
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盐池藻华期间真核生物群落结构的操作分类单位概况见数字，叶绿藻、硅藻和节肢动物物种占真核生物群落的大部分，甲藻显着增加，并在开花高峰期达到峰值丰度（>90%）。 3 J5 u! c" `6 |, Q( Q
在水华后期（W7-W9），甲藻逐渐被其他藻类群所取代，包括叶藻属（主要是四藻属和微单胞菌属）、硅藻属（地中海藻属和骨骼藻属）和其他低丰度藻类（鞘翅目、鞘翅目和链藻科），除了浮游植物，浮游动物在水华期间也表现出明显的动态。
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在水华高峰期，它们的丰度显着减少，18S OTU的大部分被亚历山大属占据，当藻华进入终止期时，真核生物多样性逐渐增加，多种生物（藻类、纤毛虫和真菌）在该水华期共同发生。
0 ^7 g- K- p1 \ 对应规范分析（CCA）用于确定微生物结构中的相关性是否与环境参数相关，在化学因素中，PO43-和否3-对细菌群落的差异贡献最大，而微真核生物群落结构的最强决定因素是IN/IP比值。 ( z% q. F3 g+ c2 d$ p
- {% S0 ~' B1 E+ d «——[ ·结论· ]——» 7 U9 [( p0 L) M6 N
微生物对藻华的反应表现出高度的异质性和复杂的动态，其中包括表现出不同功能特征的不同种群的连续性，在水华期间观察到的藻类和微生物群落结构是由环境因素和生物相互作用形成的。
: c3 J/ G' S* a, ^' m) w/ i 实验结果强调了微生物网络相互作用，细菌功能影响藻层代谢活动和藻华发展轨迹，揭示了海洋甲藻繁殖过程中微生物群落结构的动态变化，及其与甲藻繁殖活动的相关性，这些结果对于进一步理解海洋生态系统中甲藻繁殖过程的生态学机制具有重要意义，并为海洋保护与管理提供了科学依据。 & ~2 B7 Y, g$ P# `: `! m4 `3 Q
参考文献：
/ W1 W1 b1 m5 ~( i2 Y5 o$ N7 } 贝蒂尔森，巴贝拉，《微生物扩增子读取的高精度OTU序列》
- o( I4 {( k1 U5 s. ] 奥盖特，萨赫拉维，《与水华形成淡水浮游植物相关的细菌群落》 # W3 S/ p4 f B3 Q, y. Q6 D# f* ~8 u
瓜拉尔，安德烈，《硅藻和细菌之间的相互作用》 + y, p1 K, w0 a; N7 e* D1 U" N( q
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